子宫肌瘤是女性生殖器的激素依赖性良性肿瘤[1]，通常在30至50岁的女性中发现。子宫肌瘤的患病率在过去30年中在全球范围内已显着增加[2]。子宫肌瘤的主要治疗方法是手术治疗，患者不仅需要巨大的医疗费用，而且很容易复发[3]。此外，药物治疗是一个重要的选择，可以分为激素治疗和非荷尔蒙治疗[4]。保守的西药经常使用性激素药物，但长期使用可能会导致更年期症状，不可逆的骨矿物质密度损失和严重的肝损害[5]。中医中没有子宫肌瘤的名称记录。根据其症状，它被包括在“生生”，“生生生”和“生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生生”的类别中，中医在治疗子宫肌瘤的治疗中表现出明显的疗效，副作用较小，不良反应的发生率较小，并且具有广泛的应用前景[7]。

胶囊（GZFL）源自汉朝著名的中国医学医生张郑詹（Zhang ）的“ ”。它由五种药用植物组成 – 吉兹，白色牡丹，牡丹树皮，牡丹仁和Poria，比例为1：1：1：1：1 [8]。 GZFL具有促进血液循环，消除血液暂停和消除子宫肌瘤的作用。它被广泛用于子宫肌瘤的治疗，并具有明显的临床作用[9]。研究发现，与单独使用低剂量米沙晶剂相比，用GZFL的子宫肌瘤的治疗可以显着降低卵泡雌激素，雌二醇，孕酮，黄体激素，子宫肌瘤，子宫肌瘤的体积等。但是，GZFL对子宫肌瘤的抗肿瘤机制尚不清楚，需要加强家庭与家庭有关的机制研究[12]。代谢组学全面分析了代谢产物的动态变化，这与传统中医的整体概念一致，并为研究中医学作用机理和新药的发展提供了科学基础[13]。基于此，这项研究打算使用代谢组学技术来探索GZFL对人子宫肌瘤细胞及其作用机理的抑制作用。

1材料

1.1药物和试剂

人子宫肌瘤细胞购自Wuhan Life Co.，Ltd。； GZFL（批次编号-42035，江苏袋鼠制药有限公司）; （Ru-486，批量编号，上海 Co.，Ltd。）;磷酸盐缓冲溶液（PBS，批处理，生物公司）； DMEM培养基（批次编号），胎牛血清（批次编号），胰蛋白酶（批次编号），Gibco； MTS（批次编号，公司）；人类增殖细胞核抗原（PCNA）ELISA试剂盒（公司批次，公司）；人B淋巴细胞瘤-2（BCL-2）ELISA试剂盒（批量， ）；细胞周期和凋亡检测试剂盒（批次9），V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（批次9），公司；甲醇（批量编号，福顿生化技术有限公司）;无水乙醇（批量， Co.，Ltd。）;实验水是超纯水。

1.2仪器

3111二氧化碳孵化器，120质谱仪（公司）；显微镜（公司）； HH-4恒温水浴锅（ 电器有限公司）; By-320a离心机（北京 Co.，Ltd。）; Epoch 2微型读取器（公司）； THZ-312台式固定温度振荡器（上海实验设备有限公司）;流式细胞仪（公司）； Auto Eva Mini氮鼓风机（Ruike Group Co.，Ltd。）; -8S超声细胞破​​碎机（上海Daluo Co.，Ltd。）。

2种方法

2.1细胞培养

将细胞在37°C和5％二氧化碳培养箱与α-肌动蛋白抗体中培养，并被免疫细胞化学染色并鉴定为子宫肌瘤细胞。进行了具有稳定生长状态和对数生长周期的细胞进行实验。

2.2药物溶液的准备

使用50％甲醇水溶液超声提取GZFL，过滤并旋转为干性。用二甲基亚氧化二甲基氧化物（DMSO）重新溶解为母液康缘桂枝茯苓胶囊，并在使用前将其稀释至所需的浓度。 RU-486作为阳性对照母液溶解在DMSO中，并在使用前稀释。

2.3细胞活力确定

在试图在对数相中消化子宫肌瘤细胞后，将细胞悬浮液获得，并将每个孔约5×103个细胞播种在96孔板上。 24小时后，进行剂量实验。将细胞用不同质量浓度的GZFL（0.4、0.5、0.6、0.7、1.0 mg·Ml-1）和Ru-486（20、25、30、40、90μmol·l-1）处理24小时。对照组给予等量的DMSO，并建立一个空白组（不包括细胞和药物溶液），每组中有6个化合物井。随后，使用微孔板读取器在490 nm处孵育2小时，检测490 nm的吸光度（a）值，并计算细胞存活。

细胞存活率=（剂量 – 空白）/（对照 – 空白）

2.4细胞凋亡测定

采用对数生长阶段中的细胞，将每个孔约2×105个细胞播种在6孔板上，并给药24小时。将细胞用低，中和高质量浓度的GZFL（0.4、0.5、0.6 mg·Ml-1）和Ru-486（20μmol。l-1）处理24小时。在每个组中给对照组提供相等量的DMSO，并在每组中设置3个双链井。收集细胞后，使用PBS轻轻重悬于。取100,000个细胞并离心并丢弃上清液。然后加入195μl的结合溶液，5μL的V-FITC和10μL碘化丙啶（PI）染色溶液，然后轻轻混合。在室温下从光中孵育10分钟，然后通过流式细胞仪进行机上检测。

2.5细胞周期测定

采用对数期中的细胞，接种和给药方法与“ 2.4”相同。收集细胞。用预冷的PBS洗涤后，将1 ml预冷的70％乙醇加入细胞簇，轻轻放置并充分混合，将其在4°C下固定24小时，离心后丢弃上清液，然后加入1 ml的预冷PBS再次洗涤。最后，加入0.5 mL的PI染色溶液，然后均匀地添加移液器。在37°C下孵育30分钟后，使用流式细胞仪在488 nm激发波长下检测到荧光信号。

2.6bcl-2，PCNA蛋白表达检测

将细胞悬液播种在培养皿中，放置在恒温二氧化碳孵化器中，并培养直至80％融合。剂量方法与“ 2.4”相同。给药24小时后，收集细胞。将收集的细胞与预冷的PB彻底混合，以800 r·min-1离心5分钟，并洗涤3次。使用细胞超声破碎机在每次200 w，2 s，相距3 s和5分钟的总时间下分解细胞。随后，将细胞碎屑在4°C下离心以去除细胞碎屑，并收集上清液以确定蛋白质含量的测定和ELISA方法，以检测BCL-2和PCNA蛋白的表达。

2.7细胞代谢组样品制备

电池接种和给药方法与“ 2.4”相同。给药24小时后，将上清液丢弃并添加预冷的PBS以轻轻洗涤细胞。然后通过添加低温甲醇，用无菌铲刮细胞并收集细胞来淬灭细胞，并使用细胞超声破碎机破碎细胞。将样品在-20°C下孵育1小时，然后在4°C下以12 000 r·min -1离心10分钟，以去除沉淀的蛋白质，收集上清液，然后加入氮气后，加入200μL甲醇溶液。搅拌5分钟，以12000 r·min -1在4°C下离心10分钟。收集上清液进行分析。取10μl每个样品并混合以获得质量控制样品（QC）进行方法验证。

2.8代谢组学LC-MS/MS分析

色谱条件：该柱为加上C18（100mm×2.1 mm，1.8 µm），色谱柱温度为30°C，体积流量为0.4 ml·min-1，注射体积为2 µL，流动相为0.1％ Acid Acid （a） – 乙腈（a） – 乙腈（B），梯度洗脱：0：0 ：0°1 1米，2％b; 1～ 5分钟，2％～46％b; 5～ 8分钟，46 ～50％b; 8～13分钟，50 ～60％b; 13 ～17分钟，60 ～76％b; 17～25分钟，76 ～90％b; 25 ～27分钟，90％b; 27 ～29分钟，90％～2％B.对每6个样品进行一次测试，以确保没有残留杂质。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式检测，离子扫描范围设置为m/z50 ～1500；雾化气压为275.79 kPa；锥孔电压为65 V；破裂电压为135V；毛细管电压，正离子模式为4000 V，负离子模式为3 500 V；干气容量流量为10.0 l·min -1;干气温为350°C；碰撞能量分别为10、20和40 V。

2.9代谢组学数据处理

将数据导入3.3软件，标签和组细胞样品，选择0.2至28.0分钟的时间周期，将最小绝对丰度设置为500 000，基线（基线1.5倍），并在5×10-6之内进行质量偏差，并执行数据的初步提取。为初步匹配和识别选择了化合物结果，，，，和其他数据库。

The were using the peak area using the () for data, and the data was : , , and data after data was by the root of the of each , for (PCA), , and least (PLS-DA).倍数变化（FC）和t检验用于分析GZFL组和对照组，并筛选差异代谢物的FC≥1.5或Fc≤0.67，p <0.05。该平台用于进一步分析筛选中鉴定的差异代谢物。使用人类（HOMO）作为研究物种，结合代谢途径分析，筛选了与差异代谢产物有关的潜在靶途径。

2.10统计方法

Prism 9.0软件用于统计分析，并表达了数据。单向方差（ANOVA）用于比较多组，而t检验分析用于在两组之间进行比较。

3结果

3.1 GZFL对子宫肌瘤细胞的抑制作用

如图1所示，在GZFL治疗人子宫肌瘤细胞的24小时后，质量浓度不同后，细胞的存活率降低到不同程度，并显示出浓度相关性。在随后的实验中，剂量质量浓度设置为0.4、0.5和0.6 mg·Ml -1。阳性药物RU-486选择20μmol·l⁻⁻作为剂量浓度。

3.2 GZFL对子宫肌瘤细胞凋亡的影响

使用-FITC和PI进行双重染色。图2中的结果表明，右上象限是FITC+/PI+，表明坏死细胞和晚期凋亡细胞。右下象限是FITC+/Pi-，表明早期凋亡细胞。左下象限是正常细胞。对照组细胞的总细胞凋亡率为（9.4±0.2）％，低，中和高质量浓度组的细胞总细胞凋亡率为（41.1±0.7），（41.1±0.7）（52.7±1.7）％和（分别为67.1.1±0.6）％。阳性药物RU-486组细胞的总细胞凋亡率为（66.2±1.8）％。与对照组相比，GZFL组的子宫肌瘤细胞的总凋亡率随药物给药浓度的增加而增加，并且差异在统计学上显着（p <0.001）。这表明GZFL可以显着诱导人子宫肌瘤细胞的凋亡。

3.3GZFL对子宫肌瘤细胞周期的影响

图3结果表明，与对照组相比，随着GZFL给药浓度的增加，S期细胞的比例增加，高质量浓度组具有显着差异（P <0.01）。结合细胞凋亡结果的分析，GZFL诱导了细胞周期以阻断S相，从而抑制细胞增殖。

3.4 GZFL对Bcl-2和PCNA蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组相比，0.5、0.6 mg·Ml-1GZFL和RU-486可以下调人子宫肌瘤细胞中Bcl-2和PCNA的蛋白质表达，并显示浓度相关性。其中，PCNA在0.5和0.6 mg·ML-1GZFL组中的蛋白质表达显着差异（P <0.05，0.01），而RU-486组中Bcl-2和PCNA的蛋白表达显着差异（P <0.05，0.001）。

3.5代谢概况和可靠性分析的表征

质谱法用于检测每组样品。在图5中显示了正离子和负离子模式中的总离子流。为了确保数据质量的可靠性，在注射之前和执行无监督的PCA之前运行QC样本。结果表明，QC样品密切聚集，表明实验可重现（图6）。

预处理数据后，总共确定了185种化合物。对照组，RU-486组和GZFL低，中和高质量浓度（0.4，0.5，0.5，0.6 mg·ml-1）进行了无监督的PCA和聚类分析。 PCA和簇热图结果（图6）表明，每组样品之间可以实现明显的区别，这表明药物干预改变了人子宫肌瘤细胞的内源代谢物谱。部分最小二乘判别分析（PLS-DA）结果（图7）表明该模型的R2Y（cum）= 0.983和Q2（cum）= 0.902，表明该模型具有良好的分类和预测能力。同时，Q2值的合理分布及其在图7-B中的较高斜率进一步验证了该模型在当前分割条件下的稳定性。 GZFL高质量浓度组较低，并且中等质量的浓度组更偏离对照组。

3.6筛查和鉴定差分代谢产物

分析了GZFL组和对照组，并用FC≥1.5或Fc≤0.67，P <0.05筛选差异代谢产物，并鉴定了18种差异代谢物，请参见表1。

3.7分析差分代谢物的代谢途径

该网站用于分析18种差分代谢物的代谢途径的富集，并筛选了15个相关的代谢途径（图8）。将≥0.01和p <0.05用作筛查条件，最终获得了3个潜在的关键途径，请参见表2。进一步分析了精氨酸和脯氨酸代谢途径中的关键差分代谢产物，肌酸（），4-瓜氨酸丁烷丁酸丁酸（4-）和L-氟丁胺酸（L-）和图9的含量为9。 GZFL组显着降低（p <0.01），4-瓜氨酸丁二酸含量增加（p <0.01），L-谷氨酸含量显着降低（P <0.05）。

4个讨论

肿瘤的形成是由细胞增殖和凋亡之间的不平衡引起的。研究发现，GZFL可以通过细胞1（ICAM-1）和人类附子蛋白4（HE4）之间的T淋巴细胞表达下调，通过有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号传导途径抑制子宫纤维纤维纤维纤维细胞的增殖，迁移和入侵[14]；它还可以通过调节与介体复合物亚基12（MED12）相关的Wnt/β-（β-）信号传导途径来诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖[8]。 PCNA在DNA复制和修复中起重要作用[15-16]，其表达在晚期的G1和S相中急剧增加，这是细胞周期进程的标志[17]。 Maruo等。 [18]发现，整个月经周期中平滑肌瘤细胞的PCNA阳性阳性速率高于正常肌层细胞的PCNA阳性速率。 Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，其在平滑肌瘤细胞中的表达上调通常是平滑肌瘤生长的机制之一[19]，可能会在翻译水平上影响呼吸链或核糖体中的蛋白质或酶，从而调节细胞周期[20]。这项研究表明，GZFL可以诱导人子宫肌瘤细胞的凋亡，抑制细胞增殖，阻断细胞周期的进展，并下调PCNA和BCL-2的蛋白质表达，这表明GZFL对人子宫肌动物具有抑制作用，可能与PCNA和BCL-2的PCNA下降有关。

子宫肌瘤中精氨酸代谢途径的变化与肿瘤增殖和存活密切相关。作为重要的氮来源，精氨酸可以在高代谢需求下支持肌瘤细胞的生长和存活[21]。肌酸，4-瓜氨酸丁酸和L-谷氨酸是精氨酸代谢途径中的重要代谢产物。子宫肌瘤的形成触发了细胞代谢的显着变化，包括对肌酸的需求增加，从而通过促进ATP产生来支持子宫肌瘤细胞的生长[21]。肌酸具有抗氧化作用，可以减少氧化应激对肌瘤细胞的影响。由于子宫肌瘤通常位于低氧环境中，因此肌酸的抗氧化功能有助于减少自由基的产生并防止细胞损伤[22]。药物诱导的肌酸下调会导致子宫肌瘤细胞中氧化应激水平的增加，从而影响其生长和增殖。 4-瓜氨酸丁酸是精氨酸代谢途径的中间产物，与氮平衡和氨基酸代谢密切相关。肿瘤细胞使用精氨酸来维持细胞中的氮平衡，从而支持代谢需求[23]。三羧酸周期（TCA）是线粒体中氨基酸代谢的核心途径[24]，其循环效率与许多中间产物有关。 L-谷氨酸是通过精氨酸代谢产物的转化而产生的，可以通过下游途径（包括谷氨酰胺和α-酮戊二酸酯）产生关键代谢产物，这些途径直接参与能量代谢（TCA循环）。 GZFL may with and amino acid by the key of and , , 4- acid and L-, the cell and , and the of human cells.

琥珀酸是谷氨酸代谢中的重要代谢物，也是TCA循环中必不可少的循环代谢产物，有助于在线粒体代谢途径中产生能量。琥珀酸是琥珀酸脱氢酶的底物。琥珀酸脱氢酶现在被定义为肿瘤抑制剂，琥珀酸定义为肿瘤代谢产物[25]。研究表明，子宫肌瘤患者的琥珀酸脱氢酶缺陷[26]。这项研究发现，与对照组相比，GZFL干预后琥珀酸的含量被下调。这表明GZFL可能会干扰能量代谢，并通过调节l-谷氨酸和琥珀酸酯和琥珀酸酯在丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的代谢途径中影响琥珀酸酯脱氢酶，从而抑制人子宫辅助细胞的增殖。

通过色氨酸二氧酶的作用将色氨酸转化为，进一步产生3-羟基基硝氨酸，3-羟基扬扬芬酸等，并最终产生尼古丁酰胺腺嘌呤（NAD+）（NAD+），对Cell and and and and and and Inmem and and 具有重要意义。研究表明，子宫肌瘤中的色氨酸代谢与正常的子宫肌层组织不同[27]，色氨酸代谢在子宫肌瘤通过伴有途径的发生和进展中起着重要作用[28-29]。纠正色氨酸在肌瘤中的异常分解代谢可能是对肌瘤的有效治疗方法，该治疗方法是减少肌瘤细胞的增殖和细胞外基质的积累[30]。这项研究发现，与对照组相比，在高质量的GZFL浓度组中下调了3-羟基抗毒酸和N-乙酰基-N-2-甲基-5-甲氧基尼拉氨酸，而GZFL可以通过促进子宫纤维纤维的细胞来调节子宫纤维细胞，表明GZFL可以调节子宫纤维纤维细胞，从而调节了子宫纤维的细胞。途径，从而在一定程度上干扰细胞的生长和增殖。

基于UPLC-MS/MS的代谢组学技术，这项研究探讨了GZFL抑制人子宫肌瘤细胞生长的机制，提供了参考，以揭示子宫肌瘤的代谢调节机制并开发新的疗法靶标。

利益冲突所有作者宣布没有利益冲突

参考（省略）

资料来源：Jin Bin，Hu ，Ren ，Xu Winao，Wang Qian，Chen ，Cao Liang，Wang ，Xiao Wei。讨论基于细胞代谢组学技术的子宫肌瘤治疗子宫肌瘤的作用机理[J]。药物评估研究，2025，48（5）：1103-1113。